Laboratorní práce
Test akutní toxicity na žábronožkách Artemia
salina
Ing. Vladimír Kočí, PhD., Ing. Andrej Švagr, tel.:2435 4248
Charakteristika organizmu
Vajíčka žábronožky slaniskové se k nám dováží v konzervách, téměř výhradně vyráběných v USA, například firmou Ocean Star International, Inc. Vajíčka žábronožek jsou sbírána ve Velkém solném jezeře v Utahu. Jsou omyta sladkou vodou, usušena a vakuově plněna do konzerv. Běžně jsou používána jako krmivo pro akvarijní ryby.
Ač se jedná o organizmus žijící ve slaných vodách, nachází se pouze v jezerech, ne v mořích. Výhodou testu jsou značně homogenní vlastnosti vajíček a tedy i čerstvě narozených jedinců. Tím, že jsou čerstvě vylíhnutí jedinci ihned použiti pro test, odpadá náročný chov.
Řád žábronožek patří do podtřídy lupenonožců, Phyllopoda. Tělo mají vždy bez schránky, protáhlé a měkké, složené z četných článků. Dorůstají 5-70 mm. Žábronožka slanisková dorůstá 12-18 mm a žije až 4 měsíce. Na hlavě má nečlánkovaná nitkovitá tykadla prvního páru a mohutná tykadla druhého páru, která mají u samců tvar dvoučlánkových kleští (u samic jsou drobná a méně nápadná). Tykadla samců slouží k přidržování samičky při kopulaci. Z jejich základního článku často vyrůstají různé charakteristické výrůstky, jež slouží jako dobré determinační znaky. Na předním okraji hlavy se mezi tykadly někdy nachází nepárový čelní výrůstek. Na spodní straně hlavy je ústní ústrojí. Na čele jedno nepárové naupliové očko, na bocích hlavy se nalézají velké stopkaté složené oči. Hruď se skládá z jedenácti článků, z nichž každý nese ventrálně pár listových plovacích nožek. Zadeček se skládá z devíti článků; první dva články jsou spolu víceméně srostlé, nesou pohlavní orgány. U samic bývá v těchto místech upevněn nápadně zbarvený vak s vajíčky.
Žábronožky žijí ve stojatých
vodách, často především v dočasných (periodických) tůňkách vytvořených
táním sněhu apod. Žábronožka slanisková, Artemia salina, je kosmopolitně
rozšířený druh, který je velmi hojný v přímořských a vnitrozemských
tůních, slaných jezerech a solných dolech s mírně až velmi slanou vodou.
Na příhodných lokalitách je možný výskyt i na našem území. Jiným
druhem žábronožek použitelným pro testy toxicity je Artemia franciscana.
a) b)
Obr. 1 a) Vylíhlé nauplium Artemie, b) Cysty Artemie. Zdroj obrázků internet[1][*].
Skladování
Neotevřená konzerva vajíček má být uložena v chladu a suchu. Líhnivost zárodků v cystách[2][†] je zaručena zhruba jeden rok. Dají se však dobře použít i až 4 roky staré cysty. Otevřená konzerva musí být uchovávána v neporušeném igelitovém sáčku dobře uzavřeném gumičkou a uložena v ledničce. K cystám se nesmí dostat voda ani vzdušná vlhkost.
Líhnutí vajíček/cyst
Obvykle se provádí tak, že se do laboratorní mořské vody, zpravidla o salinitě 1,2-3,0 % NaCl odebere malé množství cyst. Vodu je dobré udržovat v mírném pohybu. Toho se nejlépe docílí provzdušňováním slabým proudem vzduchu. Tím se zajistí i adekvátní aerace. Je třeba nastavit proudění vzduchu tak, aby cysty vířily ve vodním sloupci a neležely na dně nebo na hladině. Líhnivost kvalitních cyst se obvykle blíží 100 %. Optimální teplota pro líhnutí je 27-29 °C, kdy k vylíhnutí dochází přibližně do 18 hodin. Snížením teploty na 25 °C nedojde ke změně v citlivosti nauplií, ale k prodloužení doby líhnutí; při této teplotě se líhnou za 24 hodin a to je pro provozní podmínky v laboratořích často příznivější. Nevylíhlá vajíčka obvykle leží na dně, prázdné skořápky plavou na hladině. Živé žábronožky jsou přitahovány světlem a lze je tedy pomocí bodového světelného zdroje dobře shromáždit na jednom místě a pak odlovit.
Z jedné konzervy lze získat až několik miliónů žábronožek u nichž je zaručena vysoká homogenita – stejné vlastnosti.
Pracovní postup:
Pro testování se používají čerstvě
vylíhnutí jedinci, tzv. nauplia. Bez krmení je životnost nauplií
v ideálních podmínkách 96 až 120 hodin. Z Petriho misek jsou vylíhnutí
jedinci přeneseni pipetou do misek s testovanými koncentracemi zkoumaného
vzorku. Během testu se žábronožky nekrmí. Testovaný roztok se neprovzdušňuje.
Zaznamenává se úmrtnost nauplií. Nejčastěji se za dobu testu volí 24 hodin.
Doporučuje se však odečítat úhyn i po delší době.[[i][1]]
Orientační test
Cílem orientačního testu je určit
interval koncentrací pro základní test. Jde o to zjistit nejnižší koncentraci,
která působí na žábronožky letálně, OC100 a nejvyšší koncentraci testovaného
vzorku, který nepůsobí toxicky, OC0. Do pěti Petriho misek se připraví zkoušená
geometrická řada koncentrací, šestá slouží jako kontrola.
Základní test
Touto zkouškou se stanoví procento
uhynulých nauplií Artemia salina v různých koncentracích k určení
hodnoty EC50. Cílem zkoušky by mělo být rovněž určení dalších hodnot (NOEC,
LOEC, LC).
Připraví se testované koncentrace zkoumaného vzorku ředěné
laboratorní mořskou vodou. Volí se obvyklým způsobem podle hodnot OC0 a OC100.
Do Petriho misek o průměru 60 mm
se odměří 10 ml zkoumaného roztoku. Podle uvážení se volí 2-3 paralelní
nasazení. Do každé Petriho misky, se odloví 10 nauplií žábronožek. Vzhledem
k velké ploše hladiny a tudíž dostatečnému přestupu kyslíku lze misku
zakrýt víčkem. Aerace se neprovádí. Teplota roztoků by se měla pohybovat
v rozmezí 22-25°C. Zaznamenává se úmrtnost nauplií po 24, a po 48, 72,
případně i po 96 a 120 hodinách. Jedná se tedy o závislost úmrtnosti
žábronožek v závislosti na koncentraci toxikantu a na čase. Po 120
hodinách již zpravidla všechny žábronožky umírají na nedostatek potravy.
S testem se nasazuje minimálně jedna kontrola. Po
stanovené době se spočítají uhynulé žábronožky. Jestliže bylo použito k
rozpuštění látky organické rozpouštědlo[3][‡],
připraví se ještě jedna kontrola s ředicí vodou, obsahující nejvyšší
koncentraci organického rozpouštědla, která byla použita v kterémkoliv
zkoušeném roztoku.
Jestliže látka vykazuje stálost v průběhu expozice, stanoví
se dle možnosti koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách alespoň na
počátku a na konci testu. [[ii][2]]
Pracovní postup pro
laboratorní práci:
- Líhnutí vajíček (1. den, pondělí, cca 10 min)
- Petriho miska se asi ze 2/3 naplní mořskou vodou ze zásobní láhve v laboratoři
- přidá se přibližně čajová lžička zamrazených suchých vajíček žábronožek
o o miska s vajíčky se na 24 hodin umístí do inkubátoru
- Nasazení organizmu (2. den, úterý, cca 35 min)
- vodní výluh se naředí mořskou zřeďovací vodou podle Tab. 2.
- 2 koncentrační řady, vč. 2 kontrol, se převedou do testovacích misek
- pomocí mikropipety se nauplia zbaví prázdných cyst a přemístí se do testovacích misek po 10 jedincích
o o misky se na 48 hodin umístí v inkubátoru
- Odečtení a vyhodnocení (3. den, čtvrtek, cca 40 min)
- vizuální odečtení mrtvých žábronožek (leží na dně)
- postup vyhodnocení viz obecná metodika
Tab. 1
|
Testovací organizmus: |
Artemia salina |
|
Barva |
světlá |
|
Velikost |
až 0,5 mm |
|
Líhnivost |
minimálně 90% |
|
Počet jedinců v jedné testovací misce |
10 |
|
Sledovaná odezva: |
mortalita |
|
Podmínky testu: |
stálá teplota, světlo (inkubátor) |
|
Opakování |
2 |
|
Objem testované koncentrace |
5 ml v 1 Petriho misce |
|
Teplota |
25 – 28 °C |
|
Doba expozice |
48 hodin (pro účely laboratoře případně jinak) |
|
Osvětlení |
světlo |
|
Chemikálie: |
výchozí roztok testované látky, laboratorní zřeďovací mořská voda |
|
Pomůcky a zařízení: |
Petriho misky, kádinky, mikropipety, inkubátor |
Pro potřeby laboratoří bude z důvodu úspory času a prostředků prováděn pouze základní test.
Před vlastním stanovením se změří pomocí automatických elektrod pH, vodivost a obsah kyslíku vodního výluhu (výsledky společné s testy na semenu).
Vodní výluh zeminy se naředí zřeďovací vodou v poměru 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 (viz Tab. 2). Dávkování se provádí pomocí mikropipet a 10 ml odměrného válečku směrem od nejnižší do nejvyšší koncentrace (odpadá nutnost mytí).
Vlastní test se bude skládat ze dvou paralelních nasazení včetně dvou kontrolních nasazení. Další postup včetně vyhodnocení je již shodný s postupem uvedeným výše. Detaily viz Tab. 1.
Tab. 2
|
Ředění |
Dávkování výluhu [ml] |
Dávkování vody [ml] |
|
1:10 |
0,91 |
9,09 |
|
1:20 |
0,48 |
9,52 |
|
1:40 |
0,24 |
9,76 |
|
1:80 |
0,12 |
9,88 |
Statistické vyhodnocení se provádí na základě postupu uvedeného v obecných pravidlech testování
toxicity.
Protokol:
Hodnocení protokolu je významnou částí
celkové známky laboratoře z ekotoxikologie a jeho forma bude posuzována na
základě všeobecně známých kriterií. Jeho odevzdání se předpokládá do týdne.