Laboratorní práce

Test semichronické toxicity se semeny Sinapis alba

Ing. Vladimír Kočí, PhD., Ing. Martin Mlejnek, tel.: 22435 4248

Účel:

Test byl vyvinut k testování neškodnosti odpadních vod, jež by mohly být použity pro závlahy např. zemědělských plodin. Testuje se vliv vody na klíčení semen a růst kořenů hořčice bílé Sinapis alba v počátečních stadiích vývoje. Test spočívá v kultivaci semen na podložkách nasycených roztoky zkoumané látky ve srovnání se semeny, které rostou na podložce nasycené ředící vodou. V testech toxicity představuje hořčice zástupce kulturních plodin a vyšších rostlin vůbec.

Charakteristika organizmu

Hořčice bílá, Sinapis alba, (Brassica alba L.) patří do čeledi brukvovitých, Brassicaceae. Je to jednoletá, časně jarní rostlina – olejnina. V půdě setrvává tenkým vřetenovitým kořenem. Lodyhu má vzpřímenou, roztroušeně chlupatou, až 150 cm vysokou s listy jasně zelené barvy. V dolní části jsou listy pravidelně lyrovitě peřenoklané až peřenodílné, v horní části trojklané. Květy jsou oboupohlavné čtyřčetné s chlupatými stopkami. Zpočátku jsou sestaveny v klubkaté květenství, později v protáhlé hrozny, kde jednotlivé květy kvetou odspoda.

Při jarním výsevu květiny kvetou v květnu až červenci, při letním lze kvetoucí hořčice vidět až do pozdního podzimu. Plody jsou odstálé, bíle štětinaté šešule, s trojžilnými až pětižilnými chlopněmi a se smáčklým, mečovitě zahnutým zobanem, který je obvykle delší nežli samotná šešule.

Kvetoucí rostliny jsou opylovány hmyzem, nejčastěji včelami, jimž poskytují pastvu v letním a podzimním období.

Pěstuje se především pro semeno, ze kterého se vyrábějí doplňky jídel. Olej, kterého obsahuje semeno 24-32%, je využíván v potravinářském průmyslu i pro technické účely na výrobu mýdel, ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu. Patří zároveň mezi krmné plodiny.

Hořčice pochází z jihovýchodního Středomoří, kde byly pěstována starověkými civilizacemi již 2000 let před naším letopočtem. V Evropě začala být pěstována v ranném středověku. Největší plochy hořčice bílé jsou v Rusku, Indii a Číně.

Semeno rostliny je na brukvovité rostliny poměrně velké, je žluté nebo bělavě žluté kulovitého tvaru. Dosahuje průměru 1,5 - 4 mm, hmotnost tisíce semen se pohybuje od 3 do 6,8 g. Po vyklíčení vyrůstá jednoduchý kořen s hypokotylem. Později je kulovitý a bohatě rozvětvený. Rostlině se nejlépe daří na středně hlinitých nebo hlinitopísčitých půdách, dobře hnojených, s dostatkem vápníku a s neutrální až mírně alkalickou půdní reakcí.

a)b)

Obr.0 a) Část stonku hořčice bílé, Sinapis alba s květem. b) Vyklíčené semeno s hypokotylem na konci třetího dne pokusu ve standardním živném médiu.

Tab. 0.1 Podmínky testu toxicity na organizmu Sinapis alba.

Testovací organizmus:	Sinapis alba
Barva	okrově žlutá
Velikost	střední, 1,5 – 2 mm
Klíčivost	minimálně 90%
Počet semen v jedné Petriho misce	15
Sledovaná odezva:	Inhibice růstu kořene ve srovnání s kontrolou
Podmínky testu:	Stálá teplota, temno
Opakování	2
Objem testované koncentrace	5 ml v 1 Petriho misce
Teplota	20°C
Doba expozice	72 hodin (pro účely laboratoře případně jinak)
Osvětlení	bez přístupu světla
Chemikálie:	Výchozí roztok testované látky, zřeďovací voda dle ISO 7346
Pomůcky a zařízení:	Petriho misky, filtrační papír, odměrné baňky, pipety, termostat, milimetrové měřítko

Pracovní postup:

Připraví se obvykle 5-10 ředění. Do tří Petriho misek pro každé ředění se rovnoměrně vloží po 15 semenech. Semena se položí na předem připravené otvory do filtračního papíru, který byl vystřižen tak, aby pokryl celé dno misky. Před vložením semen se napustí 5 ml testovaného roztoku odpovídajícího ředění. Po 72 hodinách se přesně změří délka kořene (viz Obr.1b) každé rostliny u jednotlivých koncentrací.

Vyhodnocení výsledků

Pro každé ředění se vypočítá aritmetický průměr délky kořenu z obou paralelních stanovení. Na základě průměrných délek kořenů v jednotlivých koncentracích se spočítá inhibice růstu podle následujícího vzorce:

I je inhibice růstu kořene (%)

D(k) je průměrná délka kořene v kontrole (mm)

D(t) je průměrná délka kořene v testované koncentraci (mm)

Podle získaných hodnot se určí hodnoty NOEC, LOEC a LC. Výsledné hodnoty EC10, EC50, EC90 se zjistí lineární regresí, kdy se inhibice růstu dá do závislosti na dekadickém logaritmu koncentrace. Látky obsažené ve vzorku mohou mít i stimulační efekt. K tomuto faktu je třeba přihlížet při výsledném hodnocení.

Testy akutní toxicity na referenčních látkách

Vzhledem k možným změnám stavu semen, jejich klíčivosti se doporučuje provádět kontrolu jejich stavu a podmínek provádění testů toxicity na standardu K₂Cr₂O₇ p.a. Testy akutní toxicity se provádějí za stejných podmínek a vyhodnocují stejným způsobem jako základní testy. Průměrné hodnoty a přípustné rozpětí IC50 při době expozice 72 hodin výše uvedeného standardu uvádí tabulka 1.2.

Tab. 0.2 Test semichronické toxicity na standardech pro testovací organizmus Sinapis alba.

Standard	K₂ Cr₂O₇
Rozpětí hodnot IC50 (mg/l)	10 –50

Pracovní postup při laboratorní práci:

Ředění výluhu, nasazení semene (1. den, pondělí, cca 30 min)

na dno Petriho misky se položí testovací papír, do perforace se umístí vybrané kusy semene Sinapis alba, u nichž lze předpokládat kvalitní reprodukci
vodní výluh se naředí sladkou zřeďovací vodou ve 2 koncentračních řadách, vč. 2 kontrol podle Tab. 2.

o o miska se semenem se na 72 hodin umístí do temna

Sklizení semene, změření kořene a vyhodnocení (2. den, čtvrtek, cca 35 min)

vizuální odečtení délek kořene (viz Obr. 1b)
postup vyhodnocení viz obecná metodika

Pro potřeby laboratoří bude z důvodu úspory času a prostředků prováděn pouze základní test.

Před vlastním stanovením se změří pomocí automatických elektrod pH, vodivost a obsah rozpuštěného kyslíku ve vzorku, např. ve vodném výluhu.

Vodný výluh zeminy se naředí zřeďovací vodou v poměru 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 (viz Tab. 2). Dávkování se provádí pomocí mikropipet a 10 ml odměrného válečku směrem od nejnižší do nejvyšší koncentrace (odpadá nutnost mytí).

Vlastní test se bude skládat ze dvou paralelních nasazení včetně dvou kontrolních nasazení. Další postup včetně vyhodnocení je již shodný s postupem uvedeným výše. Detaily viz Tab.1.1.

Tab. 2

Ředění	Dávkování výluhu [ml]	Dávkování vody [ml]
1:2	3,33	6,67
1:4	2,00	8,00
1:8	1,11	8,99
1:16	0,59	9,41
Kontrola	0	10

Protokol:

Hodnocení protokolu je významnou částí celkové známky laboratoře z ekotoxikologie a jeho forma bude posuzována na základě všeobecně známých kriterií. Jeho odevzdání se předpokládá do týdne.